Храм возведен в 1780 году как костел Святого Антония при монастыре францисканцев. Монахов этого ордена пригласил в Новогрудок великий князь Гедимин еще в 1323 году.
В 1831 году поддержавшие национально-освободительное восстание францисканцы «по высочайшему повелению» были вынуждены покинуть монастырь. Костел сначала закрыли, но в скором времени переоборудовали в православный храм, освятив его во имя российского императора Николая I.
В 1852 году случился сильный пожар, после которого церковь перестроили в псевдовизантийском стиле. Несмотря на это, у здания до наших дней сохранилась барочная основа.